甲型流感病毒H1亚型(IAV-H1)检测试剂盒-RT-P
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甲型流感病毒H1亚型(IAV-H1)核酸检测试剂盒(RT-P
操作步骤
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入裂解液 600 μL,充分颠倒混匀,室温静置 3~
5 min。
1.2 将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管,吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质,以免离心时 堵塞吸附柱),13000 rpm 离心 30 s。
1.3 弃去收集管中液体,加入 600 μL 洗液,13000 rpm 离心 30 s。
1.4 重复步骤 1.3。
1.5 弃去收集管中液体,13000 rpm 空柱离心 2 min,以除去残留的洗涤液。
1.6 将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管中,向柱中央加入洗脱液 50 μL,室温静置 1 min,13000 rpm
离心 30 s,离心管中液体即为模板 RNA。
2 实时荧光 RT-PCR 操作
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N,则反应体系配制如下: 试剂 体系
无菌无核酸酶水 2.7(N+1)μL
RT-PCR 反应液 10(N+1)μL
酶混合液 0.4(N+1)μL
荧光探针 1.9(N+1)μL
将以上配制的反应体系充分混匀后,分装每个反应管中各 15 μL。
分别取 5 μL 模板 RNA,加入相应反应管中,混匀并作好标记,在荧光 PCR 仪上进行以下反应:
45 ℃ 15 min,95 ℃ 1min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,在每个循环第二步(60℃ 35s)收集荧光信号,共
40 个循环。(报告基团“FAM”,淬灭基团“None”)。
结果判定
1 结果分析条件设定 阈值设定原则:阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的点。不同仪器可根据仪器噪音
情况进行调整。
甲型流感病毒H1亚型(IAV-H1)核酸检测试剂盒(RT-P2 结果描述及判定
阳性对照 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线,阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线,实验结果成 立;被检样品 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 AIV 阳性;被检样品 30<Ct<37 并出现特定的扩 增曲线,需重新取样提取 RNA,扩增后进行结果判定,如仍是可疑,可判定为阳性;被检样品 Ct 值≥37 时,超过本方法检测灵敏度范围,判定为阴性;对于某些未呈现 S 型曲线,但本底较高的样 品,应为阴性。