荧光定量PCR原理:

产品仅用于科研荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多种用途，下面就向大家介绍PCR实验方法步骤:

方法

1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、竞争法

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

b、内参照法

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

实时荧光定量PCR：

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实验过程:

一、试剂准备

1. DNA模板

2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步骤 

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．产品仅用于科研试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

赤芝酸EMLH1 (4C9C7) Mouse mAb100 ul

赤芝酸BPhospho-NPM (Thr95) Antibody100 ul

赤芝酸ACas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (PE Conjugate)100 ul

灯盏花乙素甲酯Phospho-Keratin 17 (Ser44) Antibody100 ul

赤芝酸CPhospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAb20 ul

赤芝酸LM1Phospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAb100 ul

灵芝酸GPhospho-MDM2 (Ser166) Antibody100 ul

灵芝酸FPhospho-PNK1 (Ser114/Thr118) Antibody100 ul
鸡类圆线虫探针法荧光定量PCR试剂盒干酪素0.313-20ng/mlAdenosine receptor A2b|ADORA2B

氯化锌0.313-20ng/mlAdenosine receptor A3|ADORA3

医用凡士林78.125-5000pg/mlADRb1

原钒酸钠0.156-10ng/mlADRβK1

草酰乙酸31.25-2000pg/mlAGRN|Agrin|agrin proteoglycan

硫酸锌七水(AR)15.625-1000pg/mlAgrp|AGRP(Agouti-related protein)|AGRT|ASIP2|ART|agouti-related protein|Agrt

酒石酸钾钠四水0.313-20ng/mlAhr|Aryl hydrocarbon receptor|BHLHE76|Ah receptor|AH-receptor|aromatic hydrocarbon receptor|Class E basic helix-loop-helix protein 76

缩二脲0.781-50ng/mlAlkaline Phosphatase|Intestinal|Alpi|Intestinal alkaline phosphatase I|IAP-I

硫酸镁无水(分子生物学级)0.625-40ng/mlALP(Alkaline Phosphatase)

石英砂1.563-100ng/mlALT(Alanine Transaminase)|ALAT|SGPT|alanine aminotransferase|serum glutamic pyruvic transaminase

乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐, 缩合剂3.125-200ng/mlAMPK

过硫酸钾1.563-100ng/ml AMY1|Alpha-amylase 1|Amylase Alpha 1|Salivary|1|4-alpha-D-glucan glucanohydrolase 1|Salivary alpha-amylase

3-氨基-1,2,4-三唑1.563-100ng/ml Amy2|PA|AMY2|Amy2a|Pancreatic alpha-amylase|1|4-alpha-D-glucan glucanohydrolase

磷酸钠十二水62.5-4000pg/mlANG(Angiogenin)|ALS9|HEL168|RNASE4|RNASE5

无水磷酸氢二钠(分子生物学级)15.625-1000pg/mlANP|NPPA|ANF|Cardionatrin|NPPA|PND|ANF|ANPatriopeptin|ATFB6|atrial natriuretic factor|Atrial natriuretic peptide|CDD-ANF|natriuretic peptide A|natriuretic peptide precursor A|PNDcardionatrin|prepronatriodilatin|Prepronatriodilatin

96%500g25g(20R)原人参二醇Immunoglobulin A

 BC-019(人腺细胞)5×106cells/瓶×2

8-Methoxypsoralen头孢吡肟相关物质E标准品规格：规格：人膜联蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)Polyclonal Antibody 0.2ml

小鼠凝血子IX(FIX)Cullin 7  泛素连接酶CUL7蛋白抗体规格:96T/48TCefuroxime Sodium规格:50mg成纤维细胞生长子23检测试盒20mg大鼠脑血管周细胞，RBVP细胞1x10^6cells

90%25g5g石杉Mn Super Oxidase Dimutase

无水二氢钾 质量规格：>99%,分子生物学级 Potassium phosphate, monobasic, anhydrous

Peucedanol头孢二水合物标准品规格：规格：人晚期糖基化终末产物(AGEs)Polyclonal Antibody 0.2ml

大鼠凝血子IX(FIX)CDCA7  细胞分裂周期相关蛋白规格:96T/48TCefuroxime Axetil规格:20mg程序性死亡分子1检测试盒20mg大鼠内皮祖细胞1x10^6cells

98%25g25ml糖异构酶rotavirus IgM antibody

 ZR-75-1(人腺细胞)BRL 3A, 大鼠肝正常细胞

高端化学, α溴异丁

98%100g5g糖异构酶matriptase2

异鲁米诺(>98.0%(HPLC)(T)) 质量规格：>98.0%(HPLC)(T) Isoluminol

高端化学, 钨

96%5g25g脂肪化酶Blastocystis hominis antibody

 中慢生华癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii三叶草根瘤菌 Rhizobium trifolii

高端化学, 硅钨