荧光定量PCR原理:

产品仅用于科研荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多种用途，下面就向大家介绍PCR实验方法步骤:

方法

1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、竞争法

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

b、内参照法

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

实时荧光定量PCR：

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实验过程:

一、试剂准备

1. DNA模板

2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步骤 

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．产品仅用于科研试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

安息香二甲(DMPA) 24650-42-8甲苯三酮 标准品  CAS号：69004-03-1 100mg胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)99%

安息香二甲(DMPA) 24650-42-8甲苯氟磺胺 标准品  CAS号：731-27-1 250mg血管内皮生长因子D(VEGFD)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)99%

1-乙酰咪唑 2466-76-4 三甲苯草酮 标准品  CAS号：87820-88-0 250mg白介素11(IL11)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

1-乙酰咪唑 2466-76-4 三唑酮 标准品  CAS号：43121-43-3 250mg血管内皮生长因子C(VEGFC)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

1-乙酰咪唑 2466-76-4三唑(异构体A) 标准品  CAS号：250m'g白介素12B(IL12B)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

魏因勒卜链接剂 247021-90-5三唑(异构体A和B混合物) 标准品  CAS号：250mg血管内皮生长因子C(VEGFC)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

4-吡咯烷丁胺 24715-90-0 野麦畏 标准品  CAS号：2303-17-5 250mg白介素12B(IL12B)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

6-甲氧基-2-四氢萘酮 2472-22-2苯黄隆 标准品  CAS号：82097-50-5 100mg血管内皮生长因子B(VEGFB)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)95%

6-甲氧基-2-四氢萘酮 2472-22-2 三唑磷 标准品  CAS号：24017-47-8 250mg白介素12A(IL12A)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)95%

四正丁基硫酸铵 2472-88-0苯黄隆 标准品  CAS号：101200-48-0 100mg血管内皮生长因子B(VEGFB)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)50wt%水溶液

1,3-二(4-氨苯氧基)苯 2479-46-1 标准品  CAS号：52-68-6 250mg尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

1,3-二(4-氨苯氧基)苯 2479-46-1三氯吡氧乙酸标准品  CAS号： 55335-06-3 250MG尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%

三 24800-44-0十三吗啉 标准品  CAS号：24602-86-6 100MG尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)97%

三 24800-44-0布洛芬 标准品  CAS号：141517-21-7 100MG尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)97%

Boc-Orn(Z)-OH 2480-93-5 氟菌唑 标准品  CAS号：68694-11-1 100mg血小板生成素(TPO)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)98%
贝氏贝诺孢子虫探针法荧光定量PCR试剂盒2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸钠Corin  心脏特异性丝氨酸蛋白酶抗体 100 ul

三羟基磺酸GPR55  蛋白偶联受体55抗体 1 Kit

3-[N-[三(羟甲基)甲基]氨基]磺酸钠LAP3  亮氨酸氨基肽酶3抗体 1 Kit

3-[ (N-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基磺酸LMW Kininogen/Kininogen 1  低分子量生长促进因子抗体（激肽原1） 100 ul

3-三羟-2-羟基磺酸钠KCNMB1/Maxi Potassium channel beta  钙激活钾通道蛋白β1抗体 100 ul

DIPSO单钠盐P2RX4  三磷酸腺苷门控阳离子通道蛋白抗体 100 ul

成套缓冲剂ATP6IP2  ATP酶H+转运溶酶体辅助蛋白2抗体 20 ul

PBS磷酸盐缓冲液Relaxin 1  松弛肽/松弛素抗体 100 ul

缓冲液Renalase  肾胺酶抗体 100 ul

磷酸盐缓冲液SLC12A3/NCCT  钠氯离子转运蛋白抗体 100 ul

碳酸盐缓冲液VNN1  血管非炎症分子1抗体 100 ul

TRIS-HC1缓冲液AXUD1  转化生长因子β诱导蛋白3抗体（半胱氨酸和丝氨酸富含核蛋白1） 100 ul

醋酸钠醋酸缓冲液BS69/Adenovirus 5 E1A binding protein  腺病毒5结合蛋白BS69抗体(骨形态发生蛋白受体相关分子1) 100 ul

钠盐酸缓冲液BTG3  高表达神经上皮蛋白BTG3抗体 100 ul

砂盐酸缓冲液BTG4  B细胞迁移基因4抗体 100 ul