产品及特点:

蜂房小甲虫探针法荧光定量PCR试剂盒是从土壤农杆菌 CP4 菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因，是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因，因此本公司根据探针法 qPCR 原理开发了专门用于检测蜂房小甲虫探针法荧光定量PCR试剂盒的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 根据蜂房小甲虫探针法荧光定量PCR试剂盒保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的蜂房小甲虫探针法荧光定量PCR试剂盒成分，但不能检测其他非蜂房小甲虫探针法荧光定量PCR试剂盒成分。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。

6. 本只能用于科研，足够 50 次 20uL 体系的探针法荧光定量 PCR。

PCR在分子和DNA分析中有多种用途，下面就向大家介绍PCR实验方法步骤：

方法

1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。

3结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

PCR实验步骤

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；

人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

通用原则：

1， 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。

2， 扩增子的长度应不超过400bp，理想的*能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。

4， 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

5， 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b），探针设计指导

1，在设计引物之前设计探针

2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。

3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在

4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

6， 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

7， 检测探针的DNA折叠和二级结构。

荧光化学物质：

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的*技术平台。

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。

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荧光定量PCR服务：

简介：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，主要定量PCR仪器。

1、荧光定量PCR服务要求：

（01）请您提供新鲜的且尽量多的材料；或直接提供纯化好的总RNA（大于 5 ug/样品）；或直接提供纯化好的DNA（大于 5 ug/样品）。

（02）请提供已知的全长基因序列。

（03）请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA 来源等

2、荧光定量PCR操作程序

（01）引物（探针）设计与合成。

（02）提取DNA/RNA，样本逆转录成cDNA。

（03）进行Real Time PCR实验，进行实验结果分析。

（04）实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。

3、荧光定量PCR的收费标准：

  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。