荧光PCR试剂盒供应
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【产品名称】
通用名称:荧光PCR试剂盒供应
【包装规格】48T/盒
Name :Animal disease fluorescence PCR Kit
荧光PCR试剂盒供应【预期用途】
本试剂盒适用于检测动物腺、肝、脾、肺组织及人痰、血液等标本中分离出的指标,用于指标的定量检测。
【检验原理】
本试剂盒采对指标基因设计特异性的引物和探针,用荧光 PCR 技术对指标的核酸进行体外扩增检测,用于对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
核酸提取液 | 1.5mL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
反应液 | 1.0mL×1 管 |
阳性质控品 | 50μL×1 管 |
阴性质控品 | 250μL×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【注意事项】
所有操作严格按照说明书进行;
试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
反应液应避光保存;
反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服;
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
荧光PCR试剂盒供应【使用方法】
样品处理(样本处理区)
样本前处理
组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;棉拭子取 100μL 进行提取。
【标本采集】
病死或扑杀猪,无菌采集肺部位或/非部位交界处的样品;生猪灭菌
棉拭子沾取气管分泌物,放入无菌试管中
【标本采集】
病死或扑杀猪,取分泌物、血液、*、扁桃体、*和淋巴结等
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本
运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
组织样品:称取组织样品约 0.5g,置于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,匀浆后取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;
痰、尿液等液体样品:取 100μL 于灭菌离心管中;
血液样品:取抗凝血下层血细胞 50μL,加入 100μL 双蒸水吹匀。
DNA 提取
对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液,100℃恒温处理 10min,13,000
rpm 离心 5min,取上清液转移至新的 1.5mL EP 管,-20℃保存;
DNA 的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生产的 DNA 提取试剂盒
(离心柱提取法),请严格按照试剂盒说明书进行操作。
试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | 反应液 | 酶液 |
用量(样本数为 N) | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。
加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
PCR 扩增(核酸扩增区)
将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)
NONE,请勿选择 ROX 参比荧光。
推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
结果分析判定
结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑:检测通道 Ct 值>35.0,且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。
检测方法的局限性
样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果。
质控标准
阴性质控品:无明显扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
【参考文献】
国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1280-2003 国境口岸检验规程[S].北京:科学出版社, 2003.
张志凯, 海荣, 蔡虹, 等. 耶尔森菌的多重 PCR 检测方法[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2007.
吉林省质量技术监督局. DB22/T 2081-2014 耶尔森菌核酸的测定-荧光PCR 方法[S].
荧光PCR试剂盒供应【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
患病动物:腺、肝、脾、肺组织、粪便、血液人:痰;尿液、血液
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
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